RNA seq

參考文獻: Soneson C, Love MI and Robinson MD. Differential analyses for RNA-seq: transcript-level estimates improve gene-level inferences [version 2; referees: 2 approved]. F1000Research 2016, 4:1521

前言

1.     什麼是RNA-Seq技術?

   全名為RNA Sequencing，簡稱RNA-Seq，簡單的來說，就是主要是將RNA轉為cDNA，然後直接進行高通量定序cDNA，來定量並且比較基因的表現。雖然是這幾年發展的技術，但已經成為分析transcriptome的方法，可用來組裝 transcript ，發現 splicing variants 、不同的isoforms和基因上的single-nucleotide variations等。

2.     RNA-Seq的優缺點

   RNA seq不需預先知道genome sequence，但傳統的DNA定序或是Microarray方法需預先知道genome sequence才能進行。因此，即便是尚未完全解序完成的物種，RNA seq仍能偵測其RNA的表現量。RNA-seq在分子生物學最大的突破便是能偵測到所有表現的基因，就算是尚未被發現的基因，仍能偵測其表現量，故能發現到新的基因。

另外，RNA seq 偵測基因表現量的靈敏度與解析度較傳統定序方法為高，RNA seq不只能知道RNA的表現量，同時能偵測SNP、INDEL與alternative splicing form。

    即使RNA-Seq有上述許多的好處，但它的靈敏度卻也帶來了壞處，雖然RNA-Seq能夠檢測出樣品中的所有的RNA，但這同時也是缺點，它測得了total RNA，然而细胞中大部分RNA都來自核醣體和粒線體。這就干擾了其他RNA的讀數以及mRNA表現的準確性。因此，該如何去除其他RNA的干擾，是這個平台急欲解決的問題。

材料方法

為了進一步分析RNA-Seq方法，本篇作者作了以下方法的比較

1.     C57BL/6J and DBA/2J mouse ( performed by RNA-Seq and Microarray)

Dataset: Bottomly D, Walter NA, Hunter JE, et al.: Evaluating gene expression in C57BL/6J and DBA/2J mouse striatum using RNA-Seq and microarrays. PLoS One. 2011; 6(3): e17820.

2.     zebrafish embryos (performed by RNA-Seq )

Dataset:  GSE64570 ; Yang S, Marín-Juez R, Meijer AH, et al.: Common and specific downstream signaling targets controlled by Tlr2 and Tlr5 innate immune signaling in zebrafish. BMC Genomics. 2015; 16(1): 547.

3.     sporadic Alzheimer's disease SAMP8 mice (performed by Whole transcriptome analysis; 應該就是RNA-Seq)

Dataset:  GSE69244; Currais A, Goldberg J, Farrokhi C, et al.: A comprehensive multiomics approach toward understanding the relationship between aging and dementia. Aging (Albany NY). 2015; 7(11): 937–955.

4.     Adult C57/BL6 animals ( performed by RNA-Seq and Microarray)

Dataset:  GSE72165;  Chang AJ, Ortega FE, Riegler J, et al.: Oxygen regulation of breathing through an olfactory receptor activated by lactate. Nature. 2015; 527(7577): 240–244.

結果與討論

1.     基因表現層次的測量方法比轉錄層次來的準確

使用第一組dataset，比較 20,410個基因和145,342個transcripts這些Microarray和RNA sequencing的結果如下。

A圖中每個plot代表一個基因，橫軸是RNA-Seq結果，縱軸是Array得到的基因表現結果，藍色的plotting明顯較為分散，表示基因表現的關聯性較低，兩種方法的比對率大約是86%左右，所以推測使用傳統Microarray方法準確度較低。

討論

RNA-seq 定量軟體之比較

RNA-seq是最近廣泛使用於轉錄體學的工具。藉由高通量定序科技，能達到更精確的基因表現量測定。然而，RNA-seq的定量結果可能因為生物特性或是實驗流程而有所偏差，近年來研究者們針對偏差校正開發出許多定量軟體，最後本文主要即是比較DGE、DTE、DTU/DEU等三種平台的優劣。作者採用軟體所跑出的表現量取對數值和qRT-PCR對數表現量值的相關係數來評判。根據mapping的結果，同時評估各軟體在偏差校正上的效果。分析成果指出各種軟體皆能夠達到長度效應的校正。整體而言，DTE平台中DESeq2在RNA-seq資料上具有最好的校正效果與表現。